• Ultra-Universal One Step Seamless Cloning Mix

    通用型一步法无缝克隆试剂盒

    ?398.00

    CW3036M

    50 rxns

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    推荐新品CW3467,支持连接1-10个片段,兼容高低GC同源臂、低投量和长片段等复杂场景。

    本产品是基于同源重组原理开发的一款简单、快速、高效的无缝克隆试剂盒,不依赖繁琐的酶切、连接步骤,可将DNA片段定向克隆至任意载体的任意位点,不受酶切位点限制,可以高效兼容1-5个片段同源重组。2×Ultra Cloning MasterMix中添加了独特的辅助因子及稳定剂,有效提高重组效率,50℃反应5-30min即可进行连接,阳性率达95%以上。经过优化的反应Buffer体系,兼容性更强,提高了复杂体系的克隆成功率。

    图a:单片段无缝连接示意图           图b:多片段无缝连接示意图


    ? 快速高效:1-3个片段的连接仅需5-15 min,超过3个片段的连接可以延长至30 min,克隆阳性率高达95%以上。

    ? 操作简便:不受酶切位点的限制,可在任意位点进行克。皇芷/粘末端的限制。

    ? 无缝连接:插入点不会引入不需要的碱基序列。

    ? 应用广泛:高效克隆50 bp-10 kb片段;也可结合Super pfx高保真酶,应用于定点突变。


    如下实验均使用CW3036进行重组反应,CW0808感受态细胞进行转化,CW3339 PCR mix进行菌落PCR。

    1.兼容单片段和多片段连接,阳性率高

    【实验一】使用CW3036,分别连接5 kb载体和1个,2个,3个不同插入片段,均能获得很好的克隆效果,长斑情况良好,阳性率高达100%。

    图1:不同插入片段数量克隆效果


    2.长片段克隆效果好

    【实验二】分别使用A公司同类产品和CW3036连接5 kb载体和12 kb插入片段,使用CW3036长斑更多,阳性率100%。

    图2:与同类产品长片段克隆效果对比


    3. 稳定性好

    【实验三】将CW3036在室温或37℃放置7天进行热稳定性测试,以及将其反复冻融30次进行冻融稳定性测试,与对照组相比,克隆效果不变。

    图3.1:热稳定性测试


    图3.2:冻融稳定性测试

    保存条件 运输条件
    -20℃ 冰袋
    Q1:在无缝连接体系中模板有什么注意事项?
    A1:

    (1)具体计算方法请参考说明书,若计算得到的用量超过最低/最高值,则建议直接按最低/最高用量使用;

    (2) 若载体片段过长、插入片段过长或片段数过多,克隆阳性率均会降低;

    (3) 若某一组分浓度过高可适当稀释后使用,每个组分的用量最好不低于1 μL

    4)当插入片段扩增模板是与克隆载体抗性相同的环状质粒时,推荐加入阴性对照(只加片段);

    Q2:在连接时片段和载体的浓度区间是多少?最低需要投入多少ng的片段及载体?(希望模板投入量尽可能越低越好,对样本包容度更高)
    A2:

    阳性率和菌落数相关,菌落数一定程度上说明了阳性率,如果客户没有菌落数量要求,在平板上能够挑到阳性即可,是可以调低模板,对于大片段需要投入80-200ng,小片段可放低至20-60ng,具体还需要客户自行调整。

    Q3:是否测试过极端大小片段的连接?例如5000bp与200bp大小片段能否连接?
    A3:

    连接片段不要小于200bp,最好在500bp 及以上;最大测试过12k,能够连接且阳率正确。

    Q4:该酶对同源臂的GC含量是否存在要求?
    A4:

    有要求,合成引物时GC 含量尽量在40-60 之间以确:笮有省

    Q5:成功率除以上之外,还与什么相关?
    A5:

    如果黏性末端形成稳定的二级结构,如发夹结构或者茎环结构,那么成功率会大受影响。

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